Salmonella-bakteerin diagnostiikkamenetelmien soveltuvuus alkutuotannon näytematriiseille ja biofilmin muodostus eri serotyypeillä

Abstract

Salmonella-bakteerin esiintyvyyttä tuotantotiloilla, tuotantoeläimissä sekä elintarvikkeissa valvoo Suomessa kansallinen Salmonellavalvontaohjelma. ISO 6579-1 standardin mukainen bakteeriviljely on ollut toistaiseksi ainoa menetelmä bakteerin tunnistukseen alkutuotannon näytematriiseista, mutta huhtikuussa 2021 voimaan tullut asetus zoonooseista (316/2021) mahdollistaa valvontaan kuuluvien näytteiden tutkimisen myös muilla laboratoriomenetelmillä. Nopea tunnistus on tärkeää, jotta bakteerin laaja leviäminen voidaan toimenpiteillä varhaisessa vaiheessa ehkäistä. Toimenpiteistä huolimatta bakteeri voi säilyä elinkykyisenä tiloilla pitkään, jota voi selittää bakteerien kyky muodostaa biofilmiä. Tässä tutkielmassa vertailtiin ISO 6579-1 standardin mukaisen bakteeriviljelyn ja kaupallisen qPCR-menetelmän soveltuvuutta Salmonella-bakteerin osoitukseen alkutuotannon näytematriiseilla. Lisäksi tutkittiin tuotantotiloilta eristettyjen Salmonella-kantojen biofilmin muodostusta kristalliviolettivärjäysmenetelmällä kahdessa eri lämpötilassa sekä kolmessa eri kasvatusliuoksen pitoisuudessa. Menetelmävertailun näyteotantaan kuului pakastettuja sekä tuoreita naudan uloste- ja ympäristönäytteitä. Menetelmien havaitsemisraja (LOD) määritettiin kanan ja naudan ulostenäytteillä sekä pölynäytteillä. Näytteiden esirikastus tehtiin kahdella rikastusliemellä, joiden vaikutusta menetelmien herkkyyteen arvioitiin. Menetelmävertailun ja havaitsemisrajan määrityksen perusteella qPCR-menetelmä soveltui yhtä hyvin kuin bakteeriviljely Salmonella-bakteerin osoitukseen tuoreista naudan uloste- ja ympäristönäytteistä. Bakteeriviljely sen sijaan soveltui luotettavammin bakteerin osoitukseen kanan ulostenäytteistä. Kummallakaan rikastusliemellä ei ollut vaikutusta menetelmien herkkyyteen. qPCR-menetelmä mahdollistaa tuloksen valmistumisen kahden vuorokauden sisällä, kun vastaavasti viljelyllä tuloksen valmistumiseen kuluu 3-6 vuorokautta. Biofilmin muodostuksen tutkiminen osoitti, että lähes kaikki tutkitut kannat muodostivat biofilmiä huoneenlämmössä ja alhaisessa ravinneliuoksen pitoisuudessa. Biofilmin muodostus voi olla yksi selittävä tekijä Salmonella-bakteerien pitkäaikaiseen esiintyvyyteen tuotantotiloilla.

The prevalence of Salmonella in production farms, farm animals and food are monitored by Finland's national Salmonella control program. The ISO 6579-1 standard bacterial culture has been so far the only method to detect Salmonella from primary production samples, but the decree on zoonoses (316/2021), which entered into force in April 2021, allows other laboratory methods to be used as well. Rapid diagnostic methods are needed to prevent the spread of the bacterium. Salmonella can persist long-term in production farms despite the preventing procedures and biofilm formation may facilitate the long-term persistence. This thesis compared the suitability of ISO 6579-1 bacterial culture and the real-time PCR method to detect Salmonella from primary production sample matrices. In addition, the ability of Salmonella strains to form biofilm was studied with crystal violet assay. The biofilm formation was assessed for strains isolated from Finnish farms in two different temperatures and three different concentration mediums. The comparative study of the methods included frozen and fresh cattle feces and environmental samples. The limit of detection (LOD) for both methods were determined as well with cattle and poultry feces and dust samples. Two different enrichment broths were used for sample enrichment to evaluate their possible effect on sensitivity. Based on the method comparison and the limit of detection, the qPCR method was equally suitable and sensitive as the bacterial culture for Salmonella detection from fresh cattle feces and environmental samples. However, the bacterial culture was more suitable for the detection of the bacterium from poultry fecal samples. Neither enrichment broth had an effect on the sensitivity of the methods. The qPCR method enables faster results within two days while with bacterial culture the results are obtained within 3-6 days. The biofilm assay indicated that almost all strains could form biofilm at room temperature, and in a low nutrient concentration medium. The ability to form biofilm can be one of the reasons for the long-term persistence of Salmonella in production farms.