Abolishment of antibiotic resistance in Escherichia Coli using a conjugative CRISPR-Cas9 plasmid

Kasvava antibioottiresistenssi on merkittävä ongelma, joka vaikuttaa globaalisti terveydenhoitoon, ruoantuotantoon ja taloudelliseen kasvuun. Beta-laktaamien antibioottiluokka kattaa noin kaksi kolmasosaa ihmisten käyttämistä antibiooteista. Laajan kirjon beta-laktamaasi (ESBL) -entsyymit mahdollistavat monipuolisen beta- laktaami-resistenssin useassa eri bakteerilajissa. Tässä tutkimuksessa kloonattiin konjugatiivinen CRISPR-Cas9-plasmidi, joka hyökkää pEC13 ESBL-plasmidia vastaan E. Coli-bakteerissa. Tutkimuksen CRISPR-Cas9-plasmidiin liitettiin oriT (origin of transfer) -sekvenssi, joka mahdollistaa tämän kokeellisen plasmidin konjugoimisen käyttäen toisen pLM2-plasmidin konjugaatiokoneistoa. CRISPR- Cas9-plasmidiin kohdentamiseksi pEC13-plasmidiin, siihen liitettiin myös IncFII crRNA-juoste. Tämän muokatun CRISPR-Cas9-plasmidin tulisi täten pystyä konjugoitumaan uuteen isäntäsoluun pLM2-plasmidin välityksellä, missä CRISPR- Cas9-plasmidin Cas9-endonukleaasi leikkaa pEC13-plasmidin DNA- kaksoisjuosteen sen IncFII-sekvenssin kohdalta. Leikatun pEC13-plasmidin ei tulisi enää selvitä isäntäsolussa, minkä tulisi johtaa isäntäsolun kuolemaan beta- laktaami-maljoilla. Tulokset osoittavat, että tutkimuksen CRISPR-Cas9 plasmidi konjugoituu uusiin isäntäsoluihin ja indusoitu CRISPR-Cas9-plasmidi vähentää beta-laktaamilla kasvavien isäntäbakteereiden määrää noin kahden kertaluokan verran. Kokonaisuutena, tätä tutkimusta voidaan pitää onnistuneena konseptin todistuksena, mikä näyttää, että kokeellinen CRISPR-Cas9-plasmidi on mahdollista konjugoida uuteen isäntäbakteeriin, missä sen CRISPR-Cas9-aktiivisuus huomattavasti heikentää isäntäbakteerien selviytymistä beta-laktaami-maljoilla.