Abolishment of antibiotic resistance in Escherichia Coli using a conjugative CRISPR-Cas9 plasmid

Kasvava antibioottiresistenssi on merkittävä ongelma, joka vaikuttaa globaalisti terveydenhoitoon, ruoantuotantoon ja taloudelliseen kasvuun. Beta-laktaamien antibioottiluokka kattaa noin kaksi kolmasosaa ihmisten käyttämistä antibiooteista. Laajan kirjon beta-laktamaasi (ESBL) -entsyymit mahdollistavat monipuolisen beta- laktaami-resistenssin useassa eri bakteerilajissa. Tässä tutkimuksessa kloonattiin konjugatiivinen CRISPR-Cas9-plasmidi, joka hyökkää pEC13 ESBL-plasmidia vastaan E. Coli-bakteerissa. Tutkimuksen CRISPR-Cas9-plasmidiin liitettiin oriT (origin of transfer) -sekvenssi, joka mahdollistaa tämän kokeellisen plasmidin konjugoimisen käyttäen toisen pLM2-plasmidin konjugaatiokoneistoa. CRISPR- Cas9-plasmidiin kohdentamiseksi pEC13-plasmidiin, siihen liitettiin myös IncFII crRNA-juoste. Tämän muokatun CRISPR-Cas9-plasmidin tulisi täten pystyä konjugoitumaan uuteen isäntäsoluun pLM2-plasmidin välityksellä, missä CRISPR- Cas9-plasmidin Cas9-endonukleaasi leikkaa pEC13-plasmidin DNA- kaksoisjuosteen sen IncFII-sekvenssin kohdalta. Leikatun pEC13-plasmidin ei tulisi enää selvitä isäntäsolussa, minkä tulisi johtaa isäntäsolun kuolemaan beta- laktaami-maljoilla. Tulokset osoittavat, että tutkimuksen CRISPR-Cas9 plasmidi konjugoituu uusiin isäntäsoluihin ja indusoitu CRISPR-Cas9-plasmidi vähentää beta-laktaamilla kasvavien isäntäbakteereiden määrää noin kahden kertaluokan verran. Kokonaisuutena, tätä tutkimusta voidaan pitää onnistuneena konseptin todistuksena, mikä näyttää, että kokeellinen CRISPR-Cas9-plasmidi on mahdollista konjugoida uuteen isäntäbakteeriin, missä sen CRISPR-Cas9-aktiivisuus huomattavasti heikentää isäntäbakteerien selviytymistä beta-laktaami-maljoilla.

Emerging antibiotic resistance is one of the major threats to modern healthcare as well as to global food security and economic development. Approximately two- thirds of antibiotics administered to humans are ß-lactams. The emergence of extended-spectrum ß-lactamases (ESBLs) in a variety of bacteria confers multi- resistance to ß-lactams. In this study, an ESBL-harbouring pEC13 plasmid was targeted with a CRISPR-Cas9 plasmid that is delivered to the target E. Coli cells via conjugation machinery of the conjugative plasmid pLM2. An anti-ESBL plasmid was cloned, which carries an origin of transfer (oriT) domain for the conjugation initiation along with a gene for CRISPR-Cas9. One specific guiding RNA targeting the IncFII replication initiator gene of the pEC13 plasmid was designed and annealed to the anti-ESBL plasmid. In practice, the introduction of a modified anti- ESBL plasmid through a conjugation channel into an ESBL-harbouring bacterium leads to the expression of guiding RNAs that direct the Cas9 endonuclease to cleave the ESBL-plasmid, thus compromising its maintenance in the host. The results show that the induced anti-ESBL plasmid reduces the colony forming unit count of the ESBL-harbouring host by approximately two orders of magnitude on ß-lactam plates. The same ß-lactam concentration was tested to be lethal without the pEC13 resistance plasmid. Consequently, this is a viable proof-of-principle study, which shows that an anti-ESBL CRISPR-Cas9 plasmid can be introduced into ESBL- bacteria via conjugation, and its directed endonuclease activity can substantially hinder the survival of those ESBL-bacteria in the presence of lethal ß-lactam concentration.