Interactions of PP2A inhibitor proteins with PP2A regulatory subunits

Abstract

Fosfataasit ovat tärkeitä solun sisällä tapahtuvan säätelyn kannalta. Proteiinifosfataasi 2A (PP2A) on yksi näistä säätelijöistä ja sen normaali toiminta liittyy solusyklin aktivointiin. Kun PP2A:n normaalia toimintaa häiritään, voi sen seurauksena ilmetä erilaisia sairauksia, kuten syöpää. PP2A:n toimintaa estävien inhibiittoriproteiinien on huomattu olevan mahdollinen syy tähän häiriöön. Inhibiittoriproteiinien, kuten fosfoproteiini/-endosulfiini perheen proteiinien ja Cancerous Inhibitor of PP2A (CIP2A) on huomattu estävän PP2A:ta, mutta niiden sitoutumismekanismeista PP2A:n tiedetään vähän. PP2A on heterotrimeerinen proteiini ja se koostuu tuki-, säätelijä- ja katalyyttisestä alayksiköstä. PP2A:n säätelyalayksikkö B:n sisällä on tavattu ainakin 23 erilaista isoformia. Tässä tutkimuksessa inhibiittoriproteiinien sitoutumista mitataan kolmeen eri PP2A B alayksiköön B56, B56 ja B56ε. Fosfoproteiini/-endosulfiini perheen inhibiittoriproteiinien sitoutumisvoimakuutta tutkitaan kahden erilaisen fosforylaatiota matkivan mutaation avulla. Ensin B alayksikön proteiinit tuotettiin ja puhdistettiin, ja niiden proteiiniproteiini vuorovaikutuksia tutkittiin microscale thermophoresis menetelmällä. Tulokset osoittivat, että fosfoproteiini/- endosulfiini perheen villityyppi proteiinit sitoutuivat kaikkiin tutkittuihin B56 alayksiköihin. CIP2A:n sitoutuminen oli vaihtelevaa. Fosforylaatiota matkivat mutaatiot lisäsivät sitoutumisvoimakkuutta cAMP-regulated phosphoprotein 19 kDa (ARPP19) ja cAMP-regulated phosphoprotein 16 kDa (ARPP16) kohdalla, mutta ei alfa-endosulfiinin (ENSA) kanssa.

Phosphatases are important factors in cellular regulation. Protein phosphatase 2A (PP2A) is one of these regulators and its functions are related in activation of cell cycle. When the normal functions of PP2A are disturbed it can lead to various diseases, including cancer. This disturbance can be caused by various protein inhibitors. Inhibitor proteins from cAMP regulated phosphoprotein/a-endosulfin family and Cancerous Inhibitor of PP2A (CIP2A) has already been confirmed as PP2A inhibitors, but their inhibition mechanisms are mostly unknown. PP2A is a heterotrimeric protein that consists of scaffolding, regulatory and catalytic subunit. At least 23 different isoforms have been discovered between its regulatory B subunits. In this study, the binding of these inhibitor proteins is measured with three different PP2A B subunit isoforms B56g, B56d and B56e. To activate the binding capabilities of cAMP regulated phosphoprotein/a-endosulfin family inhibitors, two different phosphomimicking mutants for each inhibitor was also tested. These B56 isoforms were first expressed and purified, and then their protein-protein interaction with these inhibitor proteins was studied using microscale thermophoresis method. The results showed that wild type cAMP regulated phosphoprotein/a-endosulfin family inhibitors bound to all these subunits. Binding of CIP2A domains was varying. cAMP-regulated phosphoprotein 19 kDa (ARPP19) and cAMP-regulated phosphoprotein 16 kDa (ARPP16) bearing phosphomimicking mutations binds to B56 isoforms, whereas alpha-endosulfine (ENSA) phosphomimicking mutation did not show binding.