Characterization of RET-expressing cells in the intestinal crypt

Abstract

Enteroendokriinisolu (EE-solu) on yksi suoliston normaalia toimintaa ylläpitävä solutyyppi, jonka on todettu välittävän hermostosta tulevia viestejä. Aikaisemmassa tutkimuksessa EE-solujen on todettu muuntuvan takaisin kantasoluiksi ja edesauttaneen suoliston uusiutumista, mikäli alkuperäiset kantasolut ovat tuhoutuneet. Näiden EE-solujen on havaittu ilmentävän RET reseptoria. RET on tyrosiinikinaasireseptori neurotrofisille kasvutekijöille, joita eritetään alueella, jossa kantasoluja sijaitsee. On mahdollista, että neurotrofiset kasvutekijät vaikuttavat suoliston kantasoluihin ja niistä polveutuvien EE-solujen tasapainon säätelyyn RET reseptorin kautta. Täten RET signaloinnilla voi olla vaikutusta suoliston uusiutumiseen ja sen kehittymiseen. Tässä tutkimuksessa haluttiin todentaa RET-solujen esiintyminen suoliston epiteelissä ja selvittää, pystyvätkö RET-solut toimimaan kantasoluina organoidikasvatuksessa. Lisäksi haluttiin tutkia, onko neurotrofisilla kasvutekijöillä vaikutusta RET-solujen erilaistumiseen tai kykyyn toimia kantasoluina. Tutkimuksessa käytettiin hiirimallia, jossa Ret geeniin oli liitetty fluoresoiva merkkigeeni. Tämän avulla RET-soluja pystyttiin leimaamaan yhdessä EE-soluille tyypillisten proteiinien kanssa sekä eristämään yksittäisiä soluja virtaussytometrialla. Yksittäisiä RET-soluja eristettiin organoidikasvatukseen sekä mitattiin geenien ilmentymistä kvantitatiivisen polymeraasiketjureaktion avulla. RET reseptoria ilmentäviä soluja löytyi sekä suolikuopakkeesta että nukkalisäkkeestä ja solut ilmensivät EE-soluille tyypillisiä proteiineja. Tutkimus ei pystynyt selvittämään neurotrofisten kasvutekijöiden vaikutusta yksittäisille RET-soluille, sillä RET-solujen kyky toimia kantasoluina ja muodostaa organoideja sai ristiriitaisia tuloksia. Suolikuopakkeista kasvatetuissa organoideissa neurotrofiset kasvutekijät kasvattivat EE-solujen määrää ja mRNA tasoja. Tässä tutkimuksessa pystyttiin todentamaan RET-solut suoliston epiteelissä EE-soluiksi ja havaittiin neurotrofisilla kasvutekijöillä olevan vaikutusta EE-solujen erikoistumiseen organoidikasvatuksessa. Yksittäisten RET-solujen kyky toimia kantasoluina ja neurotrofisten kasvutekijöiden vaikutus suoliston kantasolujen säätelyyn vaatii vielä lisätutkimusta.

One of the cell types in small intestine epithelium are hormone secreting enteroendocrine cells (EECs), which are known to interact with neuronal signals. Previously, a subset of EECs has been shown to act as reserve stem cells when homeostatic stem cells are destroyed. We found that these specific EECs express mRNA of the tyrosine kinase receptor RET. RET is the receptor for neurotrophic factors, which are secreted by fibroblasts adjacent to intestinal stem cells. We hypothesize that the stemness-differentiation balance of the EECs is regulated by neurotrophic factors via RET receptor and thus RET signaling has a role in regeneration and maturation of the intestinal epithelium. The aim of this study was to characterize RET-expressing cells in the intestinal epithelium and to test whether single RET-expressing cells act as stem cells by growing them ex vivo in organoid culture. In addition, we wanted to address whether neurotrophic factors affect the stemness or differentiation of RET+ cells. To address these aims, a specific mouse model was used where a fluorescent marker gene was inserted into a Ret gene locus enabling the co-staining of RET-expressing cells with EEC markers and isolation of single cells with fluorescence activated cell sorter followed by gene expression analysis by quantitative PCR. RET-expressing cells were found in crypts and villi and they expressed EEC markers. Isolated RET+ cells could act as stem cells in organoid culture, but the result was not repetitive giving inconclusive results. The effect of neurotrophic factors on single RET+ cells could not be achieved, however, neurotrophic factors increased the expression levels of EEC markers and the amount of EEC cells in ex vivo crypt culture. In conclusion, RET is expressed in EECs and neurotrophic factors increase EEC marker expression suggesting a role in EEC differentiation. The study could not conclude whether RET+ cells can act as reserved stem cells or whether neurotrophic factors regulate intestinal epithelium stem cells.