Show simple item record

dc.contributor.authorMäki, Anita
dc.date.accessioned2019-08-27T08:44:48Z
dc.date.available2019-08-27T08:44:48Z
dc.date.issued2019
dc.identifier.isbn978-951-39-7822-8
dc.identifier.urihttps://jyx.jyu.fi/handle/123456789/65322
dc.description.abstractUnicellular microorganisms are the most abundant and diverse lifeforms, being the basis for the existence of other organisms. However, microscopic analysis of microorganisms is a slow process, and it is often impossible for the tiny creatures. To uncover microbial diversity via molecular tools, two library preparation techniques for high-throughput sequencing (HTS) of ribosomal RNA (rRNA) genes and rRNA were developed using phytoplankton as a model target group. Bioinformatics pipelines for data trimming and operational taxonomic unit (OTU) clustering were incorporated into the study. At first, a cost- and time-efficient workflow for fluent barcoding and size trimming of sequencing templates was established. By targeting the sequencing to the same region of the template molecule, data could be optimally used for OTU-based algorithms. The lack of an extensive validation of molecular tools for phytoplankton diversity analysis gave reason to compare DNA and RNA preservation, extraction and HTS data trimming methods. All processes impacted the HTS results of a mock community, with known biomasses and carbon content for each species. In the rRNA gene-based community profiling, species richness was accurately revealed, but the relative abundances of species were biased due to the high species-specific variation in the rRNA gene copy numbers. However, rRNA-based analysis reflected the relative biomasses more closely and was recommended for studying the diversity of eukaryotes. Even in the RNA based analysis, PCR amplification with gene-specific primers can bias the outcomes, as real universal primers for amplifying eukaryotic and prokaryotic ribosomal genes are not available. Therefore, a primer-independent rRNA workflow was developed to allow directional 5′-end HTS. A significant advantage of this method is that it allows simultaneous sequencing of all domains of life. The new workflow was applied to analyse water samples from 83 Finnish lakes. Results uncovered an incredibly high diversity of organisms and partly agreed with, and partly complemented, phytoplankton microscopy results.en
dc.description.abstractYksisoluiset mikro-organismit ovat lukuisin eliömuoto, ja niiden olemassaolo on elintärkeää monisoluisille organismeille. Pienten mikro-organismien mikroskooppinen analyysi on hidasta ja usein mahdotonta. Tässä molekyylibiologisessa työssä kehitettiin DNA- ja RNA-perusteiset templaattien valmistelumenetelmät HTS-tekniikalla (high-throughput sequencing) tehtävään mikrobiyhteisöjen tutkimiseen käyttäen kasviplanktonia malliorganismina. Bioinformatiikka sekvensointidatan trimmaukseen ja OTU-klusterointiin (operational taxonomic unit) sisältyi tutkimukseen. Ensiksi kehitettiin kustannuksia ja aikaa säästävä, DNA-perusteinen HTS-templaattien indeksointi ja koon trimmausprosessi. Kohdistamalla sekvensointi templaattimolekyylien samaan kohtaan OTU-algoritmit toimivat optimaalisesti data-analyyseissä. Koska kasviplanktontutkimuksessa on ollut puute kattavasta molekylaaristen menetelmien testaamisesta, tässä työssä verrattiin solujen säilytysmenetelmien, eri DNA:n ja RNA:n eristysmenetelmien sekä HTS-datan trimmauksen vaikutuksia lopullisiin HTS-tuloksiin. Realistinen yhteisörakenne määritettiin lajien suhteellisista biomassa- ja hiilipitoisuuksista, joihin eri prosessien HTS-tuloksia verrattiin. DNA-perusteisessa yhteisömäärityksessä lajirikkaus näyttäytyi tarkasti, mutta lajien suhteelliset määrät vääristyivät suurten lajikohtaisten geenikopiomäärien vaihteluiden vuoksi. Sitä vastoin RNA-perusteinen analyysi muistutti lajien suhteellisia biomassoja paremmin ja RNA-perusteista analyysiä suositeltiin eukaryoottisten mikrobien yhteisöanalyyseihin. Myös RNA-perusteisessa analyysissä PCR-monistaminen voi vääristää tuloksia käytettäessä ribosomaalisen RNA:n geenispesifisiä alukkeita. Koska eukaryooteille ja prokaryooteille ei ole saatavilla universaalisia alukkeita, kehitettiin RNA-perusteinen, alukkeista riippumaton, suunnattu 5’-pään HTS, jolla voidaan sekvensoida kaikkien domeenien eliöt samanaikaisesti. Uutta menetelmää sovellettiin 83 Suomen järven vesinäytteiden analysointiin. Tulokset paljastivat uskomattoman suuren organismien monimuotoisuuden ja osittain vastasivat ja osittain täydensivät kasviplanktonin mikroskopointituloksia.fi
dc.relation.ispartofseriesJYU dissertations
dc.relation.haspart<b>Artikkeli I:</b> Mäki, A., Rissanen, A., & Tiirola, M. (2016). A practical method for barcoding and size-trimming PCR templates for amplicon sequencing. <i>BioTechniques, 60 (2), 88-90.</i> <a href="https://doi.org/10.2144/000114380"target="_blank"> DOI: 10.2144/000114380</a>
dc.relation.haspart<b>Artikkeli II:</b> Mäki, A., Salmi, P., Mikkonen, A., Kremp, A., & Tiirola, M. (2017). Sample Preservation, DNA or RNA Extraction and Data Analysis for High-Throughput Phytoplankton Community Sequencing. <i>Frontiers in Microbiology, 8, 1848.</i> <a href="https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01848"target="_blank"> DOI: 10.3389/fmicb.2017.01848</a>
dc.relation.haspart<b>Artikkeli III:</b> Mäki, A., & Tiirola, M. (2018). Directional high-throughput sequencing of RNAs without gene-specific primers. <i>BioTechniques, 65 (4), 219-223.</i> <a href="https://doi.org/10.2144/btn-2018-0082"target="_blank"> DOI: 10.2144/btn-2018-0082</a>
dc.relation.haspart<b>Artikkeli IV:</b> Vuorio, Kristiina; Mäki, Anita; Salmi, Pauliina; Aalto, Sanni L.; Tiirola, Marja (2020). Consistency of Targeted Metatranscriptomics and Morphological Characterization of Phytoplankton Communities. <i>Frontiers in Microbiology, 11, 96.</i> <a href="https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.00096"target="_blank"> DOI: 10.3389/fmicb.2020.00096</a>
dc.titleDevelopment of genetic phytoplankton monitoring
dc.typeDiss.
dc.identifier.urnURN:ISBN:978-951-39-7822-8


Files in this item

Thumbnail

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record