Immuunipuolustuksen akuutin vaiheen vaste kokeellisessa syövässä ja luustolihaksen toiminta immuunielimenä

Abstract

Johdanto. Syöpä ja siihen liittyvä kakeksia ovat maailman johtavia kuolinsyitä. Kakeksiassa paino laskee, lihakset surkastuvat ja yleiskunto huononee. Toisinaan kunnon heikentyminen estää syöpähoitojen jatkamisen. Kakeksiaa voidaan mahdollisesti hoitaa inhiboimalla lihasmassan negatiivisia säätelijöitä, myostatiinia ja aktiviinia. Syöpä saa aikaan myös immuunipuolustuksen akuutin vaiheen vasteen. Tämä aiheuttaa positiivisten akuutin vaiheen proteiinien lisääntyneen tuotannon maksassa ja mahdollisesti myös lihaksissa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, tuottaako luurankolihas akuutin vaiheen proteiineja kokeellisessa C26-syövässä hiirillä, koska tämä oli se ilmiö, joka löytyi proteomiikka-analyysin avulla tämän tutkimuksen ensimmäisessä vaiheessa. Menetelmät. Tutkimuksessa käytettiin BALB/c -hiiriä, joille injektoitiin paksusuolen syövästä eristettyjä tyypin 26 -syöpäsoluja (C26). Hiiret jaettiin sattumanvaraisesti neljään ryhmään. Ryhmät olivat: terve kontrolliryhmä (CTRL, N = 9), syöpäryhmä lumelääkehoidolla (C26 + PBS, N = 9), syöpäryhmä sACVR2B-Fc -hoidolla ennen syöpäsolujen injektointia (C26 + ACVR b, N = 7) ja syöpäryhmä sACVR2B-Fc -hoidolla koko intervention ajan (C26 + ACVR c, N = 8). Hiiret lopetettiin 11 vuorokautta syöpäsoluinjektion jälkeen ja lihakset irrotettiin ja näytteet homogenoitiin. Tämän jälkeen lihasnäytteille tehtiin nano-LC-HD-MSE -analyysi. Näistä proteiineista tarkasti tunnistetut ja eniten muuttuneet (kaksi uniikkia peptidiä tunnistettiin, FDR < 0,05 ja FC |1.5|) analysoitiin vielä Ingenuity pathway -analyysin avulla tarkemmin. Muutoksia proteiinipitoisuuksissa haarukoitiin pro-teomiikkatekniikan avulla, minkä jälkeen tulokset validoitiin Western blottauksella ja/tai RT qPCR:llä. Tulokset. Proteomiikka- ja Ingenuity pathway -analyyseistä nousivat esiin akuutti immuunivaste ja akuutin vaiheen proteiinit. Yksittäisistä akuutin immuunivasteen proteiineista serpiini A3N, STAT3 ja p-STAT3 määrät nousivat tilastollisesti erittäin merkitsevästi (p <0.001) lihaksessa syöpäryhmissä verrattuna kontrolliryhmään. Lisäksi serpiini A3N, fibrinogeeni ja SAA (serum amyloid A -proteiini) lähetti-RNA olivat nousseet lihaksessa tilastollisesti merkitsevästi (p <0.05) syöpäryhmissä verrattuna kontrolliryhmään. Lisäksi syöpäryhmällä fyysinen aktiivisuus laski ja lihakset (TA ja GM) surkastuivat koejakson aikana verrattuna kontrolliryhmään. Aktiviinireseptorihoidolla ei ollut tilastollisesti merkitsevää vaikutusta akuutin immuunivasteen proteiinien muutoksiin syöpäryhmään verrattuna. Johtopäätökset. Kokeellinen C26-syöpä ja siihen liittyvä kakeksia aiheuttivat tässä tutkimuksessa luustolihasten surkastumista, kehon painon laskua ja vähensivät fyysistä aktiivisuutta. Kakeksia siis toteutui 11 vuorokauden syöpäjaksolla C26 -syövässä hiirillä. Akuutin immuunivasteen proteiinien (APP) konsentraation nousu ja näiden proteiinien lähetti-RNA:n määrän lisääntyminen C26-syövästä kärsivien hiirten luurankolihaksessa vahvisti käsityksen siitä, että lihas voi toimia immuunielimenä ja voi tuottaa akuutin immuunivasteen proteiineja.

Introduction. Cancer and related cachexia are the world's leading causes of death. The ca- chexia means cancer related weight loss, muscle wasting and general condition weakened. Sometimes a deterioration of the condition prevents the continuation of cancer treatments. Cachexia may be treated by inhibiting muscle mass negative regulators, myostatin and activins. Cancer also causes an acute phase response to immune defense. This causes a positive acute phase of increased protein production in the liver and muscles. The muscle thus may acts as an immune organ. The purpose of this study was to find out if skeletal muscle produces acute phase proteins in experimental C26-cancer because this was the phenomenon found by proteomics analysis at the first stage of the study. Methods. BALB/c mice and Colon-26 carcinoma (C26) cancer were used in the study. The mice were randomized to four group. Groups are: healthy control group (CTRL, n = 9), placebo treatment group (C26 + PBS, n = 9), sACVR2B-Fc treatment only before C26 inoculation group (C26 + ACVR c, n = 7) and both before and after C26 inoculation treated group (ACVR b, n = 8). Muscles were collected on day 11 after C26 cell injection, lysed and subjected to nano‐LC‐HD‐MSE analysis. Proteins with ≥ 2 unique peptides, FDR < 0.05 and FC > |1.5| were analysed and further characterized using Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software. Acute phase proteins were determined by Western blot protein analysis and/or RT-qPCR mRNA analysis. Results. Proteomics and Ingenuity pathway analysis arose in acute immune response and acute phase proteins. From individual acute response proteins serpin A3N and phosphorylated as well as total STAT3 had statistically significantly increased (p <0.001) in cancer groups compared to the control group. In addition serpin A3N, fibrinogen and SAA messenger RNA had statistically significantly increased (p <0.05) in cancer groups compared to control group. In addition, the physical activity decreases in cancer group and the muscles (TA and GM) got smaller during the experiment compared to control group. Conclusions. In this study, experimental C26 cancer and related cachexia expressed in the skeletal muscle wasting, decreased body weight, and decreased physical activity. This con- firm that cachexia realized during the 11-day trial period C26 carcinoma in mice. The in- crease in the concentration of APP proteins and the increase in the number of messengers RNAs of these proteins confirmed the understanding that muscles could act as an immune organ, producing APP proteins.