Multixenobiotic resistance in Leptinotarsa decemlineata

Abstract

Tuhoeläinten vastustuskyky on yhä laajempi ongelma lisääntyneen torjunta-ainekäytön vuoksi. Toisinaan nopeastikin kehittyvän vastustuskyvyn mekanismit voivat vaihdella käyttäytymisen muutoksista geneettisiin muutoksiin esimerkiksi solun perustoiminnoissa. ATP:tä sitovien kasettikuljettajien (ABC) proteiiniperhe kuljettaa soluista ulos normaalin aineenvaihdunnan tuotteita, mutta myös erilaisia ympäristöstä tulevia myrkkyjä, kuten kasvien puolustusaineita, ja estää niiden haitallisen kertymisen soluihin. Osa ABC-kuljettimista on yhdistetty syöpäsolujen solumyrkkyjen vastustuskykyyn, mutta ABC-proteiinien inhiboinnin avulla syöpähoitojen teho on saatu palautettua. ABC-proteiinien manipulointi tarjoaa mielenkiintoisen mahdollisuuden tuhohyönteisten torjunnassa, mutta toistaiseksi tiedot niiden rooleista hyönteisissä ovat vähäiset. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, onko koloradonkuoriaisella (Leptinotarsa decemlineata) ABC-proteiineja ja voisiko niitä inhiboimalla lisätä kasvinsuojeluaineiden tehoa. Työssä käytin toisen toukkavaiheen toukkia kolmesta populaatiosta (Saksa, Puola, USA) ja selvitin ensin eroavatko ne toisistaan Calcein-AM:n sisäänvirtauksessa, sillä populaatioiden tiedetään eroavan toisistaan esimerkiksi vastustuskyvyssä sekä aineenvaihdunnan tehokkuudessa. Calcein-AM on ABC-proteiinien substraatti, joka soluihin päästyään fluoresoi esteraasin vaikutuksesta. Toisessa osakokeessa testasin, voiko ABC-proteiinien toimintaa inhiboida lisäämällä Calcein AM:n lisäksi kolmea eri inhibiittoria (verapamil, reversin 205, MK571). Viimeisessä osatyössä tutkin, lisääkö ABC-proteiinien inhibointi torjunta-aineen vaikutusta, toisin sanoen osallistuvatko ABC-proteiinit hyönteismyrkyn vastustuskykyyn. Tulokseni osoittavat, että populaatioiden välillä oli eroja fluoresenssin määrässä ja että fluoresoivan substraatin pitoisuuden nosto johti fluoresenssin lisääntymiseen. Inhibiittorien lisääminen ei lisännyt fluoresenssia, ja siten ABC-proteiineja ei onnistuttu yksiselitteisesti inhiboimaan. Ei ole siis varmaa, miten koloradonkuoriaisen ABC-proteiinit toimivat. Viimeisessä osatyössä ABC-proteiinien inhibiittorit yhdistettynä hyönteismyrkkyyn lisäsivät kuolleisuutta pelkkään hyönteismyrkkyyn verrattuna, mutta koska myös inhibiittorien liuotin (DMSO) yhdessä hyönteismyrkyn kanssa johti kasvaneeseen kuolleisuuteen, on epäselvää selittyvätkö erot kuolleisuudessa ainoastaan ABC-proteiineilla. Vaikka käytetyt menetelmät eivät vahvista ABC-proteiinien olemassaoloa tai niiden mekanismeja, on syytä olettaa, että koloradonkuoriaisella kyseisiä kuljettimia on. Tulevaisuudessa asiaa voisi tutkia molekyylibiologian menetelmillä, esimerkiksi transkriptomianalyysillä tai sekvensoinnilla.

The overuse and misuse of insecticides can lead to resistance in insects, sometimes within a very short time span. Currently it is known that the resistance mechanisms can vary from behavioural resistance to more complex changes in genetics behind different cell functioning, for example. ATP-binding cassette (ABC) protein superfamily is a part of normal cellular transport, and it can efflux both endo- and exogenous substances from cells and prevent the adverse effects of accumulation. It is known to be responsible of cancer cell resistance, but inhibiting the ABC system with chemosensitizers is known to reverse the resistance and increase the influx of chemotherapeutic drugs. Indeed, the ABC transporters provide an interesting opportunity in the battle against insecticide resistance, but so far the information of their specific roles in insects is limited. The purpose of this study was to investigate the presence, activity and inhibition of the ABCs and their contribution to the insecticide resistance among different Colorado potato beetle (CPB) populations. In the first experiment, differences between populations (German, Polish, USA) in their Calcein-AM influx was measured. Calcein-AM is a known substrate of the ABCs, which is in live cells transformed into fluorescent calcein by esterases. It is known, that the CPB populations differ from each other in their insecticide tolerance and in their metabolism, so it was hypothesized that the used populations would differ in their influx as well. It was also hypothesized, that an increase in Calcein-AM concentration would lead to an increase in fluorescence. In the second experiment, Calcein-AM was coupled with model ABC inhibitors. Inhibiting of the system should cause a rise in fluorescence, since the molecules could accumulate in the cells. Lastly, the contribution of the ABCs to insecticide resistance was studied. This was done using the inhibitors (verapamil, reversin 205, MK751) along with an insecticide (Decis, pyrethroid deltamethrin). The inhibitors coupled with insecticide should cause higher mortality with insecticide, since without working ABC transporters, insecticide can accumulate in the cells and lead to death. My results showed differences among populations in their Calcein-AM influx. The fluorescence also increased with increasing substrate concentration. However, I was unable to inhibit the ABCs, and thus I cannot confirm the presence of ABC system in the Colorado potato beetle. In the insecticide experiment, the inhibitors caused higher mortality with the insecticide than without, but since the solvent, DMSO, combined with the insecticide led to high mortality, it is unsure whether mortality is explained by the ABC system. In the future, the presence and role of the ABCs in the CPB could be confirmed using molecular biology, such as transcriptomics or sequencing.