TCF7-transkriptiotekijän merkitys T-auttajasolujen erilaistumisessa

Abstract

Kaikki verisolut kehittyvät luuytimen hematopoieettisista kantasoluista. Kypsyessään solut ohjelmoituvat tiettyyn kehityslinjaan ympäristöstään saamiensa signaalien ohjaamana. T-lymfosyytit kypsyvät kateenkorvassa saaden signaaleja kateenkorvan epiteelin soluilta. Usean kehitysvaiheen aikana soluista valitaan ne, jotka tunnistavat vieraat antigeenit, eivätkä sitoudu liian voimakkaasti omien solujen rakenteisiin. Kypsyttyään naiivit T-auttajasolut (Th) vapautetaan elimistöön, jossa ne antigeeninsä kohdattuaan aktivoituvat ja erilaistuvat Th1- tai Th2-soluiksi ympäristöstään saamiensa sytokiinisignaalien ohjaamaana. T-auttajasolujen tuottamat sytokiinit ohjaavat muita immuunipuolustuksen soluja. Th1 solut stimuloivat mm. makrofageja ja tappaja-T-soluja ja Th2-solut stimuloivat B-soluja. T-auttajasoluilla on merkittävä rooli myös immunivälitteisissä taudeissa, kuten autoimmuunitaudeissa, allergiassa ja astmassa.

Kun erilaistuvia Th1- ja Th2-soluja on aiemmin tutkittu mikrosiruilla, on transkriptiotekijä TCF7:n havaittu ilmenevän vähemmän Th2-soluissa kaksi vuorokautta erilaistumiskasvatuksen alettua. Havainto pitää paikkaansa myös proteiinitasolla. TCF7:n tiedetään olevan tärkeä T-solujen kehitykselle kateenkorvassa ja on ajateltu, että se voisi säädellä myös solujen erilaistumista kateenkorvan ulkopuolella. TCF7 on osa Wnt-signaalinvälitysreittiä, joka on olennainen monien kudosten ja solujen kehitykselle. Aikuisella TCF7 ilmenee vain T-lymfosyyteissä. TCF7-proteiinista on monta eri isoformia, joiden merkityksestä ei ole juurikaan tietoa. Jokaisesta isoformista on sekä lyhyt että pitkä muoto. Pitkät muodot sitovat beta-kateniinia, joka yhdessä TCF7:n kanssa aktivoi Wnt-kohdegeenien transkription, kun taas lyhyiden muotojen on ajateltu estävän transkriptiota. Tutkiaksemme TCF7:n isoformien tehtäviä T-auttajasolujen erilaistumisessa halusimme liittää TCF7:n 2S- ja 2L-isoformit vektoriin yli-ilmenemiskasvatuksia varten. Lisäksi tahdoimme erotella 2D-immunoblottauksen avulla, mitkä isoformit ilmenevät Th1- ja Th2-soluissa. Tutkimistamme näytteistä ei saatu monistettua 2L-muotoa. 2S-muotoa kloonatessa monistettiin pätkä, joka sisälsi 2S-muodon alun ja lopun. Tästä syntyvä proteiini olisi pituudeltaan vain 110 aminohappoa, eikä sisältäisi edes kokonaan proteiiniperheelle tyypillistä DNA:ta sitovaa aluetta. Kloonattu muoto tuskin on toimiva TCF7-proteiinin isoformi ja puuttuvat eksonit ovat todennäköisesti poistettu jo mRNA:sta. 2D-immunoblottauksessa TCF7-vasta-aine ei antanut signaalia, joten emme pystyneet selvittämään, mitä isoformeja Th1- ja Th2-soluissa ilmennetään.

TCF7:n merkitystä T-auttajasolujen erilaistumisessa selvitettiin hiljentämällä TCF7:n ilmeneminen siRNA:n avulla. Soluja kasvatettiin rinnakkain kontrollisolujen kanssa ja niille annettiin joko Th1- tai Th2-signaaleja. Viikon kasvatuksen aikana kerätyistä RNA-näytteistä mitattiin reaaliaikaisen kvantitatiivisen PCR:n avulla sekä TCF7:n ilmeneminen että merkkigeenejä, jotka ilmenevät enemmän joko Th1- tai Th2-soluissa. Lisäksi viimeisenä kasvatuspäivänä mitattiin virtausytometrillä paljonko solut tuottavat IFN-gammaa ja IL4:ää. Jokaisessa kasvatuksessa TCF7 oli selvästi hiljennetty kahden ensimmäisen vuorokauden aikana, mutta kasvatuksen lopussa hiljeneminen oli loppunut. Geenit, jotka kertovat T-auttajasolujen erilaistumisesta Th1-suuntaan, ilmenenivät TCF7-hiljennettyjen näytteiden Th1-soluissa vähemmän kasvatuksen kahden ensimmäisen vuorokauden aikana, mutta enemmän kasvatuksen lopussa. Th1-solut myös tuottivat hieman enemmän IFN-gammaa kuin kontrollinäytteiden Th1-solut. Th2-solujen geenien ilmenemiseen tai sytokiinituottoon ei TCF7:n hiljentämisellä näyttänyt olevan juurikaan merkitystä. Näyttäisi siltä, että kun TCF7 on hiljennetty, solujen erilaistuminen Th1-soluiksi hidastuu.