Strongavidiini - biotiinia sitova merisiilestä peräisin oleva avidiinin kaltainen proteiini

Abstract

Biotiinia eli vitamiinia H suurimmalla luonnossa tavatulla ei-kovalenttisella affiniteetilla sitovaa avidiinia ja sen bakteeriperäistä sukulaisproteiinia streptavidiini käytetään laajasti erilaisissa avidiini-biotiini teknologian sovellutuksissa. Alun perin avidiini löydettiin kananmunan valkuaisesta ja sen rakenne on myöhemmin selvitetty tarkasti. Avidiinilla ja streptavidiinilla on monia hyödyllisiä ominaisuuksia. Avidiinin ja streptavidiinin on havaittu biotiiniin sitouduttuaan olevan erittäin stabiileja proteiineja, jotka kestävät hyvin mm. proteolyyttisiä entsyymejä ja ne omaavat voimakkaan lämmönkestävyyden. Yksi avidiini koostuu neljästä samanlaisesta monomeeristä, joista jokainen pystyy sitomaan yhden biotiinimolekyylin. Avidiinin ja streptavidiinin käyttämisessä on kuitenkin rajoituksia johtuen niiden farmakokineetikasta ja immunologisista ominaisuuksista. Näihin ongelmiin on pyritty löytämään vastauksia uusista avidiinin kaltaisista proteiineista, jotka ovat erilaisia mm. fysikaalisilta ja kemiallisilta ominaisuuksiltaan. Avidiniin kaltaisia proteiineja on löydetty mm. bakteereista, lintujen ja matelijoiden munista, merisiilestä sekä viimeisimmäksi sienestä. Näitä proteiineja vertailemalla on havaittu proteiinien olevan varsin konservatiivisia biotiinia sitovalta aminohapposekvenssinsä osalta. Proteiinien ominaisuuksia on tutkittu myös mutaatiolla, jolloin eri aminohapposekvenssejä on siirretty proteiinista toiseen. Näin on pystytty parantamaan monia avidiinin ominaisuuksia kuten esimerkiksi lämmönkestävyyttä, säilyttämällä samalla biotiininsitomiskyky. Tässä tutkimuksessa tutkittiin Strongylocentrotus purpuratus merisiilen genomista löydetyn geenin koodaaman avidiinin kaltaisen proteiinin, strongavidiinin, ominaisuuksia. Strongylocentrotus purpuratus merisiilestä peräisin olevasta viidestä geenistä ainoastaan yhtä onnistuttiin monistamaan ja sen proteiinia tuottamaan. Aikaisemmin merisiilestä löydettyjen fibropelliinien, jotka myös ovat avidiinin kaltaisia proteiineja, ei ole havaittu sitovan biotiinia. Strongavidiinin kuitenkin havaittiin sitovan voimakkaasti biotiinia. Strongavidiinia onnistuttiin tuottamaan E. coli bakteerissa ja puhdistamaan 2-iminobiotiinikolumnilla. Strongavidiinin havaittiin muistuttavan avidiinia rakenteeltaan sekä monilta ominaisuuksiltaan, kuten biotiinin sitomiskyvyltään. Biotiinin sitomiskyky varmistettiin ITC-mittauksilla (Isothermal titration calorimetry). Proteiinin muita ominaisuuksia tutkittiin SDS-PAGEn, ELISAn ja immunoblottauksen sekä Dot-blottauksen avulla. Strongavidiinin isoelektrisen pisteen voitiin havaita eroavan avidiinin ja streptavidiinin isoelektrisestä pisteestä. Erittäin matala isoelektrinen piste aiheutti mm. sen, että immunoblottausta ei saatu suoritettua strongavidiinille. Strongavidiinin matala isoelektrinen piste (3,91) näytti aiheuttavan monessa vaiheessa mittausongelmia. Lämpökäsitellyissä näytteissä biotiinin sitoutumisen strongavidiinin havaittiin nostavan strongavidiinin lämmönkestävyyttä. Sitoutumattomassa muodossaan lämmönkestävyys näytti heikommalta kuin avidiinin ja streptavidiinin lämmönkestävyys. Strongavidiinilla näyttää esiintyvän ristiinreagoimista avidiinin ja streptavidiinin vasta-aineiden kanssa Dot-bolttauksella suoritettuna sekä ELISA-mittauksissa. Strongavidiinilla on kolme kysteiinitähdettä ja kaksi näistä saattaa muodostaa monomeerien sisäisiä rikkisiltoja samalla tavoin kuin avidiinin monomeereissä. SDS-PAGElla ilman β-merkaptoetanolin pelkistävää vaikututusta suoritetuissa kokeissa, strongavidiini esiintyi osittain tetrameerisessä muodossa. Tämä viittaa siihen, että strongavidiini muodostaa myös alayksiköiden välisiä rikkisiltoja.

Avidin and its bacterial analogue streptavidin, which both bind to the vitamin biotin with the highest affinity for non-covalent interactions found in nature, are widely used tools in numerous applications in (strept)avidin-biotin technology. Avidin was first extracted from chicken egg white and its structure is well known. Avidin and streptavidin have many useful characteristics. They are very stabile proteins, especially when bound to biotin. Avidin and streptavidin are resistant to proteolytic enzymes and they have high thermal stability. Avidin contains four identical avidin monomers, which each bind one biotin molecule. Although, avidin and streptavidin have become widely used tools in the life sciences, their pharmacokinetics and immunological defectiveness is limiting this use. These problems have lead to search of new biotin binding proteins with different physical and chemical properties. Avidin-like proteins have been found for example in bacteria, bird and reptail eggs, sea urchin and recently in mushrooms. Compared to avidin, avidin-like proteins have very conserved amino acid sequence in their biotin-binding site. Characterization of avidin and proteins similar to avidin has been conducted using other avidin-like proteins as templates in mutations. Modifications have enhanced many properties in avidin, like thermal stability, without affecting biotin binding ability. In present study avidin-like protein, named Strongavidin, encoded by a genome sequence from the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus was characterized. Only one gene from original five genes encoding avidin-like proteins from the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus produced successfully. Previously discovered avidin-like fibropellins from the sea urchin did not bind to biotin. However, strongavidin was found to bind strongly to biotin. Strongavidin was produced in E. coli bacteria and purified with 2-iminobiotin column. Strongavidin resembles avidin by its structure and many characteristics, including biotin binding ability. Biotin binding capability was verified with Isothermal titration calorimetry (ITC) analysis. Characterization of strongavidin included also SDS-PAGE, ELISA, immunoblotting and Dot-blotting procedures. Strongavidin diverges from avidin and streptavidin by its isoelectric point. Due to low isoelectric point, we were not able to perform immunoblotting to strongavidin. In many procedures, low isolectric point (3,91) of strongavidin appeared to cause problems. In heat treatment SDS-PAGE assay strongavidin showed increased thermal stability when bound to biotin. Furthermore, in the absence of biotin strongavidin seems to have lower thermal stability than avidin and streptavidin. In cross reactivity analysis conducted with Dot-blotting and ELISA assay with avidin and streptavidin antibodies, some cross-reactivity was observed with strongavidin. Strongavidin has three cysteine residues and two of them, according to the known avidin structure, could form an intramonomeric disulfide bridge. Additionaly, tetrameric forms were observed in the SDS-PAGE samples boiled in reducing condition in the absence of β-mercaptoetanol, indicating that strongavidin does have intermonomeric bridges.