Bradavidiinista johdetun bradpeptidin karakterisointi ja soveltuvuus affiniteettikromatografiaan

DSpace/Manakin Repository

Show simple item record

dc.contributor.author Grönroos, Toni
dc.date.accessioned 2012-05-16T09:42:11Z
dc.date.available 2012-05-16T09:42:11Z
dc.date.issued 2012
dc.identifier.uri http://urn.fi/URN:NBN:fi:jyu-201205161669 en
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/123456789/37850
dc.description.abstract Bradavidiini on Bradyrhizobium japonicum bakteerista löydetty avidiinin ja streptaviidiinin kaltainen proteiini. Avidiini on peräisin kanasta ja streptavidiini Streptomyces avidinii bakteerista. Bradavidiinin aminohapposekvenssi on noin 30 prosenttisesti samankaltainen avidiinin ja streptavidiinin ydinalueiden sekvenssien kanssa. Bradavidiini koostuu 138 aminohaposta ja C-terminaalisesti pienennetty bradavidiini, ns. bradcore, 118 aminohaposta. Bradavidiinilla on useimpien avidiinien tapaan tetrameerinen kvaternaarirakenne ja se muistuttaa sekä rakenteeltaan että toiminnaltaan avidiinia ja streptavidiinia. Bradavidiinilla on muiden avidiinien tapaan kyky sitoa voimakkaasti D-biotiinia. Avidiinien sitoutuminen biotiiniin on johtanut niiden laajaan käyttöön avidiini-biotiini teknologiassa, esim. lääketieteessä geeniterapiaan ja kuvantamiseen. Avidiini ja streptavidiini ovat myös stabiileja lämmön ja pHn vaihteluille sekä proteolyyttisille entsyymeille. Immunologisilta ominaisuuksiltaan bradavidiini on kuitenkin (strept)avidiineista poikkeava. Jäniksen ja ihmisen streptavidiinia tunnistavat seerumit eivät reagoineet bradavidiinin kanssa merkittävästi. Avidiinista ja streptavidiinista poiketen, täysimittaisen bradavidiinin karboksyylipäässä on lyhyt aminohappohäntä, joka kykenee sitoutumaan viereisen monomeerin biotiinia sitovaan kohtaan ja mahdollisesti estämään biotiinin sitoutumisen. Strep-tag ja Strep-tag II ovat yhdeksän aminohappotähteen mittaisia peptidejä, jotka sitoutuvat luontaisesti ja palautuvasti streptavidiinin biotiinia sitovaan kohtaan. Strep-tag ja Strep-tag II peptidejä käytetään mm. affiniteettikahvoina rekombinanttiproteiinien puhdistuksessa sekä analyyttisinä työkaluina immunokemiallisissamäärityksissä. Strep-tag II kykenee Strep-tagista poiketen sitoutumaan streptavidiinin biotiinia sitovaan kohtaan sekä C- että N-terminaalisena fuusiona. Brad-tag on kahdeksan aminohappotähteen pituinen peptidi, jonka sekvenssi (SEKLSNTK) löydettiin bradavidiinin karboksyylipäässä olevasta aminohappohännästä. Isotermisella tirauskalorimetrilla (ITC) tehtyjen mittausten perusteella bradpeptidi sitoutuu bradavidiiniin, mutta ei sitoudu avidiiniin tai rhizavidiiniin. Bradpeptidin affiniteetti bradavidiinin C-terminaalisesti lyhennettyyn muotoon, bradcoreen, on hieman suurempi kuin Strep-tag ja Strep-tag II peptidien affiniteetti streptavidiiniin. Näiden lupaavien tutkimusten perusteella tuotettiin tehostetun vihreä fluoresoivan proteiinin (EGFP) kanssa bradtag-EGFP fuusioproteiineja. Fuusio tehtiin joko EGFPn C- tai N-terminaaliin. Tarkoituksena oli selvittää toimiiko Brad-tag fuusioproteiinissa ja onko C- tai N-terminaalisilla fuusioilla eroa. Mutatoitujen bradpeptidien affiniteettia bradcoreen pyrittiin selvittämään ITC-mittauksilla. Bradtag-EGFP fuusioproteiineja saatiin tuotettua, kuitenkin N-terminaalisen Brad-tagin sisältävien fuusioproteiinien tuottotasot olivat huomattavasti C-terminaalisia Brad-tag fuusioproteiineja korkeammat. Erilaisilla bradcore-resiiniin tehdyillä sitoutus- ja puhdistuskokeilla selvitettiin, että Brad-tag sitoutuu EGFPn aminoterminaalisena fuusiona bradcoren biotiinia sitovaan kohtaan ja sitä voidaan käyttää aminoterminaalisena affiniteettikahvana. Mutaatioilla havaittiin olevan heikentävä vaikutus bradpeptidien ja bradcoren välisessä sitoutumisessa.
dc.format.extent 59 s.
dc.language.iso fin
dc.rights This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited. en
dc.rights Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty. fi
dc.subject.other affiniteettikahva
dc.title Bradavidiinista johdetun bradpeptidin karakterisointi ja soveltuvuus affiniteettikromatografiaan
dc.type Book en
dc.identifier.urn URN:NBN:fi:jyu-201205161669
dc.subject.ysa avidiini
dc.subject.ysa streptavidiini
dc.subject.ysa proteiinit
dc.type.dcmitype Text en
dc.type.ontasot Pro gradu fi
dc.type.ontasot Master’s thesis en
dc.contributor.tiedekunta Matemaattis-luonnontieteellinen tiedekunta fi
dc.contributor.tiedekunta Faculty of Mathematics and Science en
dc.contributor.laitos Bio- ja ympäristötieteiden laitos fi
dc.contributor.laitos Department of Biological and Environmental Science en
dc.contributor.yliopisto University of Jyväskylä en
dc.contributor.yliopisto Jyväskylän yliopisto fi
dc.contributor.oppiaine Biotekniikka fi
dc.date.updated 2012-05-16T09:42:11Z

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record