Avidiini-HABA-kompleksin karakterisointi ja kontrollointi

Abstract

Avidiini on tetrameerinen proteiini, jota on tutkittu ja käytetty paljon ligandien sitomiskykynsä ansiosta. Avidiinin luonnollinen ligandi on biotiini, jonka affiniteetti avidiiniin on erittäin voimakas (Kd=10-15 M). Avidiini kykenee sitomaan myös muita ligandeja, mutta pienemmällä affiniteetilla. Yksi avidiiniin sitoutuvista molekyyleistä on HABA (4’-hydroksiatsobentseeni-2-karboksyylihappo) -atsoväri, jota on käytetty avidiini-biotiiniteknologiassa hyväksi.

HABA-molekyylillä on kaksi eri rakenteellista isomeerimuotoa, trans- ja cis-isomeerit. Yleensä se esiintyy tasomaisena molekyylinä eli trans-isomeerina, mutta se voi menettää tasomaisen rakenteensa ja ilmentyä tällöin cis-isomeerinä. Avidiiniin sitoutuessaan HABA:n väri muuttuu keltaisesta punertavaksi, ja sitoutuminen voidaan havaita spektroskooppisilla menetelmillä absorption muutoksena. Lisäksi useita erilaisia HABA:n johdannaisia on syntesoitu, ja ne sitoutuvat avidiiniin eri affiniteetilla.

Tässä työssä määritettiin atsovärimolekyyli HABA:n ja avidiini-HABA -yhdisteiden ominaisuuksia spektro-skooppisilla, kromatografisilla ja kalorimetrisilla menetelmillä. Lisäksi HABA-molekyylin ja yhden sen joh-dannaisen (TAM-017) sitoutumista avidiiniin tutkittiin eri olosuhteissa, kuten eri liuottimissa ja pH-arvoissa. Näiden molekyylien sitoutumista avidiiniin sekä HABA-molekyylin konformaatiota yritettiin myös kontrol-loida valon ja liuoksen pH:n avulla. Tällöin pH:n havaittiin vaikuttavan HABA:n ja avidiinin väliseen vuorovaikutukseen. Mikäli HABA-yhdisteiden konformaatiota ja sitoutumista avidiiniin voidaan kontrolloida jonkun ulkoisen tekijän avulla, HABA-tyyppisiä molekyylejä voitaisiin hyödyntää laajalti eri tieteenaloilla. Tämän tutkimuksen tulosten perusteella pH näyttäisikin olevan käyttökelpoinen parametri HABA:n sitoutumisen kontrolloimiseksi.